Diagnóstico de malaria humana mediante PCR
- Recolección de muestras de sangre humana obtenidas por punción en el dedo.
- La sangre se vertió sobre papel de filtro (Whatman 3 MM, Whatman International, Maidstone, Inglaterra) y se secó al aire a temperatura ambiente antes de almacenarla en bolsas de plástico individuales con gel de sílice.
- Para cada muestra, se colocaron dos muestras de sangre seca de 1,5 mm de diámetro en el pocillo de una microplaca de PCR de 96 pocillos.
- Para eliminar la hemoglobina, se agregaron 70 µL de agua de grado de biología molecular a cada pocillo y la placa se incubó a 50 ° C durante cinco minutos, 21 ° C durante 15 s, 50 ° C durante 1,5 min y 21 ° C durante 15 s.
- Para el protocolo nest1, se agregó un volumen total de mezcla maestra de 25 µL directamente a los pocillos que contenían manchas de sangre.
- Una vez completado el nest1, la microplaca se centrifugó a temperatura ambiente a 1000 G durante 3 min.
- Se transfirieron 3 µL de producto de PCR nest1 a una nueva microplaca para realizar la reacción nest2 con un volumen final de 20 µL. Los productos de PCR de Nest2 se analizaron mediante electroforesis en un gel de agarosa al 1,5% teñido con bromuro de etidio.
- Todos los ensayos de PCR de 18s-rRNA se amplificaron en una máquina Eppendorf Master Cycler (Eppendorf) o GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems).
Interpretación cuantitativa de resultados
De los 102 pacientes examinados, el 51% presenta malaria humana y el 49% restante no presentó signos de la enfermedad.
A continuación podrás ver un video explicativo sobre la malaria, en el que viene incluido su diagnóstico.
Referencias bibliográficas
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